第99回薬剤師国家試験｜薬学理論問題 / 問133 Q. 図は、ある被検化合物について、ネズミチフス菌（Salmonellaentericaserover Typhimurium）の TA100株を用いて Ames試験を行った結果である。この実験に関する記述のうち、正しいのはどれか。

選択肢

1. ネズミチフス菌の TA100株は、ヒスチジン要求性である。

2. 復帰変異部位の DNA配列は、野生株の当該部位の DNA配列と常に同一である。

3. 被検化合物は、塩基対置換型の変異原性を示す。

4. S9mixは、動物の肝可溶性画分に NADPH などの補酵素類を加えたものである。

5. 被検化合物の S9mix による代謝産物は、変異原性を示さない。

（論点：遺伝毒性試験）

こんにちは！薬学生の皆さん。BLNtです。解説します。薬剤師国家試験の衛生 / 遺伝毒性試験を論点とした問題です。第99回薬剤師国家試験の問133（問99-133）では、Ames試験に関する理解が問われました。類題に、第102回薬剤師国家試験　問132があります。合わせてチャレンジ！事前に学習しておくと、問99-133の論点である遺伝毒性試験 / Ames試験について理解が深まります。

第102回薬剤師国家試験｜薬学理論問題 / 問132 Q. 化学物質の遺伝毒性試験に関する記述のうち、正しいのはどれか。

問102-132の論点解説はこちら。3回にわたって解説！｜

第1回　選択肢5. 遺伝毒性の評価 / 遺伝毒性試験、選択肢1. 変異原性試験 / Ames試験(1)

第2回　選択肢2. 変異原性試験 / Ames試験(2)

第3回　選択肢4. 変異原性試験 / 小核試験、選択肢3. インディケーター試験 / コメットアッセイ・不定期DNA合成試験

問99-133（論点：遺伝毒性試験 / Ames試験）の科学的根拠としては、文献1、文献2および文献3（下記）が参考となると思います。問99-133を5つのテーマに分けて解説します。苦手意識がある人も、この機会に、Ames試験を一緒に完全攻略しましょう！第1回は、選択肢1、2、4および5について解説します。第2回は、選択肢3について解説します。※出来たて論点解説、特別大公開！

第1回　2018/12/12 14:00 公開予定　https://matsunoya.thebase.in/blog/2018/12/12/140000

第2回　2018/12/13 08:00 公開予定　https://matsunoya.thebase.in/blog/2018/12/13/080000

選択肢1. Ames試験 / ヒスチジン要求性

選択肢2. Ames試験 / 復帰突然変異

選択肢4. Ames試験 / 代謝的活性化(1) S9 mix

選択肢5. Ames試験 / 代謝的活性化(2) データの評価

選択肢3. Ames試験 / 突然変異の分類

解説します。Ames試験 / ヒスチジン要求性を論点とした記述です。文献2に詳細な解説がありましたので引用します。Ames試験は、細菌（Salmonella Typhimurium / ネズミチフス菌）の変異株を用いる復帰突然変異試験です。変異株はヒスチジン (histidine) 生合成に関与する酵素遺伝子に変異があるため、ヒスチジン(-)培地上では生育できません（ヒスチジン要求性）。しかし、変異している遺伝子に、化学物質の作用によって、再び変異が起こった場合、ヒスチジンを合成できるようになり（ヒスチジン非要求性）、ヒスチジン(-)培地上でコロニーを形成します。

試験菌株の表現型がヒスチジン要求性からヒスチジン非要求性に復帰するため、復帰突然変異試験と呼ばれ、多くは変異部位の周辺あるいはtRNA遺伝子に変異が起きて表現型が復帰します（suppressor mutations）。変異部位が変異することによって元に戻る（true back mutations）場合がありますが、主要な変異ではありません。このため、多様な変異を検出することができます。

解説します。S9 mixについて問われました。文献2から引用します。in vitro試験に用いられる細菌・ほ乳類培養細胞は、一般に薬物代謝酵素活性（CYP酵素等）を欠いています。一方、遺伝毒性を有する物質の多くは薬物代謝酵素などにより代謝的活性化され、生じた活性代謝物がDNA損傷を誘発します。化学物質の代謝物の遺伝毒性を検索する場合には、S9（肝臓ホモジネートの9,000xg上清）を添加して試験を行います。

ヒト肝組織画分の調整法（フナコシ｜ヒト・動物肝由来画分 https://www.funakoshi.co.jp/contents/65635 Sekisui XenoTech社カタログ）によれば、肝臓のホモジネートを12,000 gmaxで遠心分離した上清がS9 fraction（S9）です。この画分は、組織ホモジネートから細胞膜などが取り除かれたサイトゾルとミクロソームの混合物です。様々な薬物代謝酵素が含まれます。S9をさらに104,000 gmaxで遠心分離した上清がcytosolic fractionです（サイトゾル｜可溶性画分と呼ばれる場合があります。近年は可溶性画分という言葉を使用しなくなったようです。）。

S9にはNADPHなどの電子伝達系に関わる補助因子を添加します。S9と補助因子の混合液をS9 mixと呼びます。類題に、問102-132　選択肢2（問102-132-2）があります。問102-132-2の論点解説（ https://matsunoya.thebase.in/blog/2018/12/10/140000 ）でも解説しています。

解説します。設問の図、横軸は、被検化合物の試験系への添加濃度、縦軸は、ヒスチジン(-)培地における復帰突然変異（ヒスチジン非要求性に復帰）に起因する細菌コロニー数です。S9 mix非添加系とS9 mix添加系の細菌コロニー数を比較すると、S9 mix添加系で細菌コロニー数が減少しており、復帰突然変異が減少したと考えられます。

その要因としては、未変化体が代謝されて減少し、一方、代謝物が増加したことによって、未変化体による遺伝子突然変異が減少し、代謝物の増加は、代謝的活性化、つまり、未変化体よりも強い遺伝子突然変異の誘発に寄与しなかったことが推察されます。このグラフに見られる結果から、代謝物は、未変化体と比較してより強い変異原性を示さない、代謝的活性化を示さない可能性が示唆されました。しかしながら、未変化体と代謝物が、試験系の中でどのような比率で存在するか不明です。「代謝物が変異原性を示さない」ことは、代謝物を被検化学物質として評価すべきです（文献1-3）。

（第2回につづく。。｜12/13 AM08:00公開予定！）

YouTube｜※論点解説動画で予習・復習ができます。

文献1. 厚生労働省　職場のあんぜんサイト｜有害性・GHS関係用語解説＞変異原性　http://anzeninfo.mhlw.go.jp/user/anzen/kag/kag_yogo.html

文献2. 国立医薬品食品衛生研究所安全性生物試験研究センター変異遺伝部＞関連リンク http://www.nihs.go.jp/dgm/link.html

用語の解説 http://www.nihs.go.jp/dgm/words.html

OECD遺伝毒性試験ガイドライン http://www.nihs.go.jp/hse/chem-info/oecdindex.html TG471：細菌復帰突然変異試験 (1997.7.21採択) http://www.nihs.go.jp/hse/chem-info/oecd/tgj/tg471j.pdf

文献3. PMDA｜Safety：安全性　非臨床に関するガイドライン＞ICH-S2 https://www.pmda.go.jp/int-activities/int-harmony/ich/0054.html 医薬品の遺伝毒性試験および解釈に関するガイダンスについて(PDF)ステップ5, 2012.9.20 https://www.pmda.go.jp/files/000155984.pdf

【A】は、【B】の変異株を用いる【C】で、変異株は【D】生合成に関与する酵素遺伝子に変異があるため、【D】(-)培地上では生育できない（【D】【E】）。しかし、変異している遺伝子に、【R】の作用によって、再び変異が起こった場合、【D】を合成できるようになり（【D】非【E】）、【D】(-)培地上でコロニーを形成する。試験菌株の表現型が【D】【E】から【D】非【E】に復帰するため、【C】試験と呼ばれ、多くは【F】の周辺あるいはtRNA遺伝子に変異が起きて表現型が復帰する（【G】）。【F】が変異することによって元に戻る（【H】）場合があるが、主要な変異ではない。このため、【I】を検出することができる。【J】を有する物質の多くは【K】などにより【L】され、生じた【M】が【N】を誘発する。一方、【O】試験に用いられる【P】・【Q】培養細胞は、一般に【K】活性（CYP酵素等）を欠いているため、【R】の代謝物の【J】を検索する場合には、【S】を添加して試験を行う。【S】にはNADPHなどの電子伝達系に関わる補助因子を添加する。【S】と補助因子の混合液を【S】 mixと呼ぶ。未変化体に【T】がなく、代謝物に【T】がある場合、【S】 mix添加によって、【S】 mix非添加と比較して、【C】による【U】が増加する。ICHガイダンス「医薬品の【J】試験および解釈に関するガイダンス」によれば、【A】での【T】の評価は、【V】を検出し、げっ歯類およびヒト【J】発がん物質の大部分を検出することができるとされる。医薬品の【J】試験では、【A】に、【Q】細胞での 【O】 および／または in vivo 【J】の評価を組み合わせる。経済開発協力機構（OECD）ガイドラインにおいては、【A】を用いて、【W】の検出の有無を評価する。突然変異は、一般に、塩基配列レベルでの変異を指標にした【X】と、染色体レベルでの突然変異を指標にした【Y】に分類される。さらに【X】は、【W】と、より大きな変異（欠失、挿入等）に分けられる。塩基置換には、トランジッション(transition)とトランスバージョン(transversion)がある。他方、フレームシフト変異は、1-2塩基の欠失あるいは付加により、【Z】ことにより遺伝子機能が不活化する変異である。

A. 細菌を用いる復帰突然変異試験（Ames試験）

B. 細菌（Salmonella Typhimurium / ネズミチフス菌）

C. 復帰突然変異

D. ヒスチジン (histidine)

E. 要求性

F. 変異部位

G. suppressor mutations

H. true back mutations

I. 多様な変異

J. 遺伝毒性（genotoxicity）

K. 薬物代謝酵素

L. 代謝的活性化

M. 活性代謝物

N. DNA損傷

O. in vitro

P. 細菌

Q. ほ乳類

R. 化学物質

S. S9（肝臓ホモジネートの9,000xg上清）

T. 変異原性

U. コロニー形成

V. 妥当性のある遺伝的変化

W. 点突然変異（塩基対置換およびフレームシフト突然変異）

X. 遺伝子突然変異

Y. 染色体異常

Z. mRNAから蛋白質への翻訳の際の枠組み（3塩基ずつのコドン）がずれる

では、問題を解いてみましょう！すっきり、はっきりわかったら、合格です。

第99回薬剤師国家試験｜薬学理論問題 / 問133 Q. 図は、ある被検化合物について、ネズミチフス菌（Salmonellaentericaserover Typhimurium）の TA100株を用いて Ames試験を行った結果である。この実験に関する記述のうち、正しいのはどれか。

選択肢

1. ネズミチフス菌の TA100株は、ヒスチジン要求性である。

2. 復帰変異部位の DNA配列は、野生株の当該部位の DNA配列と常に同一である。

3. 被検化合物は、塩基対置換型の変異原性を示す。

4. S9mixは、動物の肝可溶性画分に NADPH などの補酵素類を加えたものである。

5. 被検化合物の S9mix による代謝産物は、変異原性を示さない。

（論点：遺伝毒性試験）※できたて論点解説、大公開中▼