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解説します。変異原性試験から小核試験を論点（テーマ）とした記述です。文献2の解説および文献3の図を引用してin vitro小核試験について解説します。ほ乳動物細胞を用いた in vitro 小核試験では、細胞分裂が阻害されて生じる小核を検出し、化学物質の染色体異常誘発性を検索します。ほ乳動物細胞（齧歯類細胞またはヒト末梢血リンパ球の初代培養細胞）で実施されます。

図1に、文献3からげっ歯類の骨髄における小核生成機構（文献3, Fig.1）を抜粋して示します。染色体異常が誘発された状態では、染色分体（acentric fragment）は、細胞質中に小核(micronucleus)を形成します。染色体異常では、染色体の構造異常に由来する動原体(centromere)を持たない染色分体、または、分裂装置に異常が起きたため嬢核に取り込まれなかった染色分体が発生して小核を形成します。赤血球の生成過程において、最終の細胞分裂時に染色体異常が誘発されると、その一部が小核を形成し、脱核の過程で細胞質内に取り残され、本来無核の赤血球中に小核が出現します。小核形成の効率は、染色体異常の型により異なり、単純な切断ではそれらの約90％が小核を形成し、一方、交換型の異常はその約35％程度が小核を形成します。小核試験では、化学物質処理した細胞の細胞分裂あるいは核の分裂を終了させて細胞染色し、脱核後間もない幼若な赤血球を顕微鏡下に観察し、小核を有する幼若赤血球の出現頻度から、最終細胞分裂時における染色体異常誘発性を推定します。染色体の形態観察と比較すると、脱核後の（核がない）細胞の小核の検出は容易なので、より簡便に染色体異常誘発性を検索することが可能です。

図1　げっ歯類の骨髄における小核生成機構ほ乳動物細胞（齧歯類細胞またはヒト末梢血リンパ球の初代培養細胞）出典：文献3, Fig. 1

なお、染色体異常は、第一義的には化学物質がDNA鎖切断を誘発するため起こりますが、他の因子（培地のpH・浸透圧の変化・アポトーシスの誘発等）によっても誘発され、偽陽性結果が多い難点があります。

解説します。遺伝毒性試験のうち、インディケーター試験を論点（テーマ）とした記述です。遺伝毒性試験(genotoxicity tests)は(1)変異原性試験(mutagenicitytests)と(2)インディケーター試験(indicator tests)に分類されます。

コメットアッセイおよび不定期DNA合成試験についての理解を問われました。文献2に詳細な解説がありましたので引用します。化学物質による染色体切断後の修復の度合いを観察する試験は、不定期DNA合成(UDS)試験です。DNA付加体を除去修復する際のDNA合成を不定期DNA合成(unscheduled DNA synthesis｜UDS)と呼びますが、このDNA修復合成を行う細胞数を計測することによって化学物質のDNA損傷作用を検索する試験法を、不定期DNA合成(UDS)試験といいます。化学物質処理した細胞で、S期以外の細胞周期に3HチミジンあるいはBrdUを取り込んだ細胞数を計測します。

一方、コメットアッセイ（アルカリ単細胞ゲル電気泳動法）は、DNA鎖切断を検出する試験です。DNA鎖の切断は、欠失、転座など染色体異常の原因となります。DNAをアルカリ条件下におくと、対合するポリヌクレオチド鎖が分離するため単鎖DNA切断が検出できるようになります。細胞を温和に破壊しアルカリ条件下で電気泳動を行います。DNA染色して細胞を顕微鏡で観察します。切断されたDNA断片は陽極側に早く泳動するため、彗星の尾(comet tail)のような泳動像が得られます。Comet tailを定量することにより、化学物質のDNA損傷性（DNA鎖切断）を調べます。in vitroおよびin vivoの試験があります。

インディケーター試験は、変異原性試験と比較して、迅速・簡便に結果を得ることができますが、陽性の結果が必ずしも突然変異や染色体異常の誘発を意味するものではないので、多くは、他の遺伝毒性試験（特に変異原性試験）で結果を確認します。

YouTube｜※論点解説動画で予習・復習ができます。

(1)選択肢1-選択肢2 こちら→ https://youtu.be/gD3nMruKX-E

選択肢1. 変異原性試験 / Ames試験(1)

選択肢2. 変異原性試験 / Ames試験(2)

(2)選択肢3-選択肢5 こちら→ https://youtu.be/-tUP3e4aCN8

選択肢3. インディケーター試験 / コメットアッセイ・不定期DNA合成試験

選択肢4. 変異原性試験 / 小核試験

選択肢5. 選択肢5. 遺伝毒性の評価 / 遺伝毒性試験

(3)第3回　まとめ / 遺伝毒性試験の一覧 こちら→  https://youtu.be/ezP1PeUFbME

文献1. 厚生労働省　職場のあんぜんサイト｜有害性・GHS関係用語解説＞変異原性　http://anzeninfo.mhlw.go.jp/user/anzen/kag/kag_yogo.html 

文献2. 国立医薬品食品衛生研究所安全性生物試験研究センター変異遺伝部＞関連リンク http://www.nihs.go.jp/dgm/link.html 用語の解説http://www.nihs.go.jp/dgm/words.html

文献3. J-Stage｜林 真, げっ歯類を用いる小核試験の基礎研究ならびにその行政面への応用, 環境変異原研究, 27(1), 13-20, 2005 DOI https://doi.org/10.3123/jems.27.13

新規【A】届出時の【B】試験の規定としては、【A】の【C】（【D】）ならびに【E】に基づく規定がある。これら新規【A】届出時の【B】試験では、【F】を用いる【G】突然【B】試験（【H】）、および、【I】を用いる【J】試験を用い、【B】の有無を評価する。世界保健機関/【A】安全性国際プログラム（WHO/IPCS）は、【K】と【B】を区別し、【K】は、【L】の誘発および【L】に基づく広義の毒性（【M】だけでなく、【N】・姉妹染色分体交換・【O】の誘発、など含む）を意味し、【B】は狭義の【K】（【S】【M】・【J】誘発 / 嬢細胞や次世代に【P】毒性）としている。【H】は、細菌（【Q】）を用いる【G】【M】試験である。【Q】は【R】生合成に関与する酵素【S】に変異があるため、【R】(-)培地上では生育できない【R】要求性をもつが、変異している【S】に、【A】の作用によって、再び変異が起こった場合、【R】を合成できるようになり、【R】非要求性となって、【R】(-)培地上で【T】する。菌株の表現型が【R】要求性から【R】非要求性に【G】するため、【G】【M】試験と呼ばれ、多くは【U】の周辺あるいはtRNA【S】に変異が起きて表現型が【G】するsuppressor mutationsである。【U】が変異することによって元に戻る（true back mutations）場合があるが主要な変異ではない。このため、【V】することができる。in vitro【K】試験に用いられる細菌または【I】は、一般に【W】を欠いているため、【A】の代謝物の【K】を検索する場合には、【X】を添加して試験を行う。肝臓のホモジネートを12,000gmaxで遠心分離した上清が【X】である。【X】は、ホモジネートから細胞膜などが取り除かれたサイトゾルとミクロソームの混合物で、NADPHなどの電子伝達系に関わる補助因子を添加して【X】 mixとして用いる。【X】をさらに104,000 gmaxで遠心分離した上清がサイトゾルである。未変化体に【B】がなく、代謝物に【B】がある場合、【X】 mix添加によって、【X】 mix非添加と比較して、【G】変異による【T】が増加する。【B】試験の【J】試験として、ほ乳動物細胞を用いた in vitro 【Y】試験があり、細胞分裂が阻害されて生じる【Y】を検出する。染色体の形態観察と比較すると、【Y】の検出は容易であり、より簡便に【J】誘発性を検索することが可能である。【K】試験のインディケーター試験として、【A】による染色体切断後の修復の度合いを観察する試験がある。DNA修復合成を行う細胞数を計測することによって【A】の【L】作用を検索する試験法であり、【N】(UDS)試験という。一方、【Z】は、【O】を検出する試験である。

A. 化学物質

B. 変異原性（mutagenicity）

C. 審査及び製造等の規制に関する法律

D. 化審法

E. 労働安全衛生法

F. 微生物

G. 復帰

H. Ames試験

I. ほ乳類培養細胞

J. 染色体異常

K. 遺伝毒性（genotoxicity）

L. DNA損傷

M. 突然変異

N. 不定期DNA合成

O. DNA鎖切断

P. ゲノム変化が伝わる

Q. Salmonella Typhimurium/ネズミチフス菌の変異株

R. ヒスチジン

S. 遺伝子

T. コロニー形成

U. 変異部位

V. 多様な変異を検出

W. 薬物代謝酵素活性（CYP酵素等）

X. S9

Y. 小核

Z. コメットアッセイ

では、問題を解いてみましょう！すっきり、はっきりわかったら、合格です。

第102回薬剤師国家試験｜薬学理論問題 / 問132 Q. 化学物質の遺伝毒性試験に関する記述のうち、正しいのはどれか。

選択肢

1. Ames試験は、化学物質の遺伝毒性を Salmonella Typhimurium変異株の復帰突然変異の出現頻度により検出する方法である。

2. Ames試験で用いる細菌は、ヒトや動物の組織と同様の異物代謝反応を起こす変異株である。

3. 化学物質による染色体切断後の修復の度合いを観察する試験として、特定の細菌を用いたコメットアッセイがある。

4. ほ乳動物細胞を用いた in vitro 小核試験では、細胞分裂が阻害されて生じる小核を検出する。

5. 遺伝毒性の有無は、Ames試験に加え、げっ歯類又はほ乳動物細胞を用いた試験を組み合せて評価される。

（論点：遺伝毒性試験）※できたて論点解説、大公開中▼